Umfassende Analyse der Kodierung und Nicht-Kodierung

Apr 26, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9252 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Morbus Wilson (WD) ist eine autosomal rezessive Erkrankung mit genetischer Grundlage. Das vorherrschende nichtmotorische Symptom von WD ist eine kognitive Dysfunktion, obwohl der spezifische genetische Regulationsmechanismus unklar bleibt. Tx-J-Mäuse mit einer Sequenzhomologie des ATP7B-Gens zum menschlichen Gen von 82 % gelten als das am besten geeignete Modell für WD. Diese Studie verwendet Tiefensequenzierung, um die Unterschiede in den RNA-Transkriptprofilen, sowohl kodierenden als auch nicht-kodierenden, sowie die funktionellen Merkmale des regulatorischen Netzwerks zu untersuchen, das an der kognitiven Beeinträchtigung von WD beteiligt ist. Die kognitive Funktion von tx-J-Mäusen wurde mithilfe des Water Maze Test (WMT) bewertet. Profile langer nichtkodierender RNA (lncRNA), zirkulärer RNA (circRNA) und Messenger-RNA (mRNA) wurden im Hippocampusgewebe von tx-J-Mäusen analysiert, um differentiell exprimierte RNAs (DE-RNAs) zu identifizieren. Anschließend wurden die DE-RNAs zum Aufbau von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) sowie von DE-circRNAs und lncRNAs-assoziierten konkurrierenden endogenen RNA-Expressionsnetzwerken (ceRNA) und kodierend-nichtkodierenden Koexpressionsnetzwerken (CNC) verwendet. Um ihre biologischen Funktionen und Pfade aufzuklären, wurden die PPI- und ceRNA-Netzwerke einer Pfadanalyse der Gene Ontology (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) unterzogen. Insgesamt 361 differentiell exprimierte mRNAs (DE-mRNAs), darunter 193 hochregulierte und 168 herunterregulierte mRNAs, 2627 differentiell exprimierte lange nichtkodierende RNAs (DE-lncRNAs), bestehend aus 1270 hochregulierten und 1357 herunterregulierten In der tx-J-Mäusegruppe wurden im Vergleich zur Kontrollmäusegruppe lncRNAs und 99 differentiell exprimierte zirkuläre RNAs (DE-circRNAs), bestehend aus 68 hochregulierten und 31 herunterregulierten circRNAs, beobachtet. Genontologie (GO) und Signalweganalysen ergaben, dass DE-mRNAs in zellulären Prozessen, Kalziumsignalwegen und mRNA-Überwachungswegen angereichert waren. Im Gegensatz dazu wurde das DE-circRNAs-assoziierte konkurrierende endogene RNA-Netzwerk (ceRNA) hinsichtlich kovalenter Chromatinmodifikation, Histonmodifikation und Axonführung angereichert, wohingegen das DE-lncRNAs-assoziierte ceRNA-Netzwerk hinsichtlich der dendritischen Wirbelsäule angereichert war, was die Regulierung der Zellmorphogenese betrifft in der Differenzierung und im mRNA-Überwachungsweg. Die Studie präsentierte die Expressionsprofile von lncRNA, circRNA und mRNA im Hippocampusgewebe von tx-J-Mäusen. Darüber hinaus wurden im Rahmen der Studie PPI-, ceRNA- und CNC-Expressionsnetzwerke aufgebaut. Die Ergebnisse sind wichtig für das Verständnis der Funktion regulatorischer Gene bei WD, die mit kognitiven Beeinträchtigungen einhergehen. Diese Ergebnisse bieten auch wertvolle Informationen für die Diagnose und Behandlung von WD.

Morbus Wilson (WD) ist eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung, die durch Mutationen im Gallengang-Kupfertransporter ATP7B verursacht wird und eine übermäßige Ansammlung von Kupfer (Cu) im Gewebe verursacht. Sie wurde 1912 von Kinnear Wilson eingeführt1. Das ATP7B-Gen ist eine ATPase vom P-Typ das die richtige Kupferkonzentration im Körper aufrechterhalten kann. Mutationen dieses Gens führen zur Anreicherung von Kupfer in verschiedenen Geweben und Organen, darunter Leber, Gehirn, Hornhaut und Niere2. Daher variiert das klinische Erscheinungsbild von WD von einem asymptomatischen Zustand über hepatische, neurologische, ophthalmologische bis hin zu psychiatrischen Zuständen3. Eine Lebererkrankung kann als erste klinische Manifestation des Morbus Wilson (WD) auftreten und eine Reihe von Symptomen aufweisen, zu denen asymptomatische erhöhte Leberenzyme, akute Hepatitis, schwere Hepatitis, kompensierte/dekompensierte Zirrhose und sogar akutes Leberversagen gehören4. Nach hepatischen Manifestationen sind neurologische Symptome das häufigste klinische Symptom, das sich in Form von Bewegungsstörungen unterschiedlichen Ausmaßes wie Tremor, Dystonie oder Parkinsonismus sowie nichtmotorischen Funktionsstörungen wie Dysarthrie, Dysphagie, psychiatrischen Störungen, kognitiven Dysfunktionen und Persönlichkeitsstörungen äußern kann usw.5. Eine pathologische Kupferablagerung im Auge kann auch zu für WD typischen ophthalmologischen Manifestationen wie Kayser-Fleischer-Ringen und Sonnenblumen-Katarakt führen6. Darüber hinaus kann die Kupferablagerung im Herzen Herzrhythmusstörungen, Kardiomyopathie usw. verursachen; Eine Nierenerkrankung kann zu einer tubulären Dysfunktion, Nierensteinen, Hyperkalziurie usw. führen. das Skelettsystem kann sich als Osteoporose, Knorpelkalzium, Arthrose usw. manifestieren; und das weibliche Fortpflanzungssystem kann sich durch unregelmäßige Menstruation, Unfruchtbarkeit, gewohnheitsmäßige Fehlgeburten usw. bemerkbar machen.7. Kognitive Dysfunktion ist das wichtigste nichtmotorische Symptom in neurologischen Systemen. Kirk et al. fanden heraus, dass bei mehr als der Hälfte der stabilen WD-Patienten unabhängig vom Phänotyp eine kognitive Beeinträchtigung vorlag und im Langzeitverlauf der Krankheit bestehen blieb8. Als eine der wenigen behandelbaren angeborenen genetischen Erkrankungen könnte eine frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung von WD eine wirksame Kontrolle ermöglichen9.

In unserer Studie wurden tx-J-Mäuse als Tiermodell verwendet. Nach Untersuchungen des Jackson Laboratory führte die Kupferansammlung im Hippocampus bei tx-J-Mäusen zu Verhaltensstörungen und Gedächtnisstörungen10. Frühere Studien haben auch bestätigt, dass eine Überaktivierung der mitochondrialen Autophagie in Hippocampusneuronen von tx-J-Mäusen zu kognitiven Dysfunktionen führen kann11. Darüber hinaus berichtete eine andere Studie, dass 82 % der Menschen und 91 % der tx-J-Mäuse die gleiche Aminosäuresequenz des WND-Proteins haben, das über funktionelle Domänen verfügt, die kupfertransportierende ATPasen enthalten12. Daher sind tx-J-Mäuse ein gültiges Modell für die Untersuchung von WD.

Nichtkodierende RNA ist ein heißes Thema im aktuellen Bereich der Neurowissenschaften. Ihnen fehlen proteinkodierende Funktionen, während sie die Transkription und Translation durch Chromatinstruktur13, RNA/Protein-Gerüst, Schwamm- und epigenetische Modifikationen, selektives Spleißen usw. regulieren können14. Die Vielfalt und Komplexität nichtkodierender RNAs und verwandter Genkontrollnetzwerke spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung physiologischer Pathologien15. Eine Studie, die die Genexpressionsprofile der Alterung des Hippocampus untersuchte, ergab, dass eine Dysregulation des Immunglobulins ein potenzieller Mechanismus der Alterung des Hippocampus sein könnte, was Aufmerksamkeit auf die Rolle der auf den Hippocampus fokussierten Immunität im Alterungsprozess erfordert16. Die Sequenzierung des gesamten Transkriptoms und eine verfeinerte Analyse können dabei helfen, die Funktionen von ncRNAs zu identifizieren und zu untersuchen. Im Vergleich dazu werden derzeit keine Studien zum ncRNA-miRNA-mRNA-ce-Netzwerk ganzer Transkriptomprofile im Hippocampusgewebe von tx-J-Mäusen veröffentlicht.

Diese Studie liefert eine Beschreibung der kodierenden und nicht-kodierenden RNA-Expressionsprofile im Hippocampus-Gewebe von Personen mit Morbus Wilson (WD). Wir haben die unterschiedlich exprimierten lncRNAs, circRNAs und mRNAs identifiziert und ein neuartiges Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) und Koexpressionsnetzwerk aufgebaut. Darüber hinaus verwendeten wir DE-circRNAs, lncRNAs-assoziierte ceRNA-Netzwerke und eine GO/KEGG-Signalweganreicherungsanalyse, um ihre Funktionen umfassend vorherzusagen. Schließlich verwendeten wir quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR), um die Expression von Genen zu bestätigen, die mit WD assoziiert sind. Unsere Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen von WD und Strategien zur Diagnose und Behandlung von WD-bedingten kognitiven Beeinträchtigungen bei.

Nach einem viertägigen Trainingsprogramm wurden die Mäuse am fünften Tag einem Positionierungsexperiment unterzogen. Das Experiment umfasste den Vergleich der Fluchtlatenz und der Schwimmdistanz im Quadranten gegenüber der Plattform zwischen der WD-Gruppe und der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse zeigten, dass die WD-Gruppe signifikant höhere Werte aufwies als die Kontrollgruppe, mit einem statistisch signifikanten Unterschied (Abb. 1a, b). Darüber hinaus wurden die durchschnittliche Fluchtlatenz und die Gesamtschwimmstrecke in den drei Quadranten, mit Ausnahme des Plattformquadranten, zwischen den beiden Gruppen verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die WD-Gruppe höhere Werte aufwies als die Kontrollgruppe, mit einem statistisch signifikanten Unterschied (Abb. 1c, d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass tx-J-Mäuse unter den gleichen Trainingsbedingungen mehr Zeit benötigen und längere Distanzen schwimmen, um die Plattform zu finden, was auf deutlich geringere räumliche Lern- und Gedächtnisfähigkeiten als normale Mäuse hinweist.

Analyse der räumlichen Lern- und Gedächtnisfähigkeiten mittels MWM-Tests. (a) Escape-Latenz des gegenüberliegenden Plattformquadranten (**P < 0,01). (b) Schwimmdistanz des gegenüberliegenden Plattformquadranten (**P < 0,01). (c) Durchschnittliche Escape-Latenz von drei Quadranten mit Ausnahme des Plattformquadranten (*P < 0,05). (d) Gesamtschwimmstrecke mit Ausnahme des Plattformquadranten (*P < 0,05).

Wie in Abb. 2 gezeigt, zeigten die Ergebnisse der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung, dass der Hippocampus in den Pyramidenzellen des CA1-Bereichs der Kontrollmäuse dicht angeordnet und regelmäßig war, mit glatten Pyramidenzellkernen und dichtem peripheren Nervenfilz, durchsetzt mit einigen Gliazellen, guter Morphologie und reichlich Kapillaren. Im Gegensatz dazu waren die Hippocampus-Pyramidenzellen von tx-J-Mäusen in der WD-Gruppe zahlenmäßig reduziert, locker angeordnet, mit erweiterten Zellabständen, stark reduzierten Pyramidenzellwerten, leichten Ödemen, leicht gefärbtem Zytoplasma und Kernen, lokalisiertem Pyramidenzellverlust und transparent ringartige Bänder um die Zellen und markante Zelltodmerkmale (Abb. 2a). Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Anzahl überlebender neuer Neuronen im Gyrus dentatus des Hippocampus in der WD-Gruppe signifikant reduziert war (Abb. 2b).

Die morphologischen Veränderungen im Hippocampus zweier Gruppen. (a) Die Ergebnisse der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (× 400). Der Pfeil in der Abbildung zeigt, dass die Pyramidenzellen des Hippocampus ödematös sind, der Zellspalt erweitert ist und sich um sie herum ein transparentes ringförmiges Band befindet und der Zelltod vorliegt. (b) Die Ergebnisse der DAPI-Färbung, der BrdU-Markierung und der Zusammenführung von Hippocampus-Neuronen (× 20 μm). Der Pfeil zeigt einen signifikanten Rückgang der Anzahl neu gebildeter Neuronen im Hippocampus der WD-Gruppe.

Wir haben DE-RNAs mit der EdgeR-Methode analysiert und dabei die Kriterien P < 0,05 und |log2FC|> 1,5 befolgt. Venn-Diagramm, Vulkandiagramm und Clustering-Karte wurden verwendet, um die DE-RNAs darzustellen, wie in Abb. 3 dargestellt. Abbildung 3a – c zeigt das Venn-Diagramm, das Vulkandiagramm und die Clustering-Heatmap von DEGs. Abbildung 3d–f zeigt das Venn-Diagramm, das Vulkandiagramm und die Cluster-Heatmap von DELs. Abbildung 3g–i zeigt das Venn-Diagramm, das Vulkandiagramm und die Cluster-Heatmap von DECs. Detaillierte Informationen finden Sie in den Ergänzungstabellen S1, S2, S3. Detaillierte Informationen zu den 20 am häufigsten hochregulierten und herunterregulierten DECs/DELs/DEGs im tx-J-Hippocampus sind in den Tabellen 1, 2 und 3 aufgeführt.

Expressionsprofile von DE-RNAs. (a–c) Expressionsprofile von DE-mRNAs. (d–f) Expressionsprofile von DE-lncRNAs. (g–i) Expressionsprofile von DE-circRNAs. Das Venn-Diagramm (a, d, g), das auf Jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html) aufgetragen ist, zeigt die Anzahl überlappender DE-RNAs in der WD-Gruppe im Vergleich zu Kontrollgruppe. In Vulkandiagrammen (b, e, h), die mit den OECloud-Tools (https://cloud.oebiotech.com) durchgeführt wurden, stellen blaue Punkte herunterregulierte DE-RNAs dar, während rote Punkte hochregulierte DE-RNAs darstellen. In der mit Heatmapper (http://www.heatmapper.ca/) erstellten Heatmap (c,f,i) stellen die blauen Rechtecke verringerte DE-RNAs und die roten Rechtecke erhöhte DE-RNAs dar.

Insgesamt wurden im Vergleich zur Kontrollgruppe insgesamt 361 DE-mRNAs (193 Hochregulierung und 168 Herunterregulierung), 2627 DE-lncRNAs (1270 Hochregulierung und 1357 Herunterregulierung) und 99 DE-circRNAs (68) gebildet 31 Hochregulierung und 31 Herunterregulierung) wurden im tx-J-Hippocampus identifiziert.

Da festgestellt wurde, dass neunundneunzig circRNAs signifikante Veränderungen mit WD in der RNA-Seq aufweisen, ist die Zuverlässigkeit der Ergebnisse unbekannt. Um die Zuverlässigkeit zu bestätigen, wurden sechs circRNAs mit relativ starken Faltungsänderungen in der RNA-Seq zufällig für die qRT-PCR-Validierung ausgewählt, darunter drei hochregulierte circRNAs (mmu_circ_0001700, mmu_circ_0001662 und mmu_circ_00013859) und drei herunterregulierte circRNAs (mmu_circ_0001859, mmu_circ_0000626 und mmu_circ_0000460). Wie in Abb. 4 dargestellt, zeigen die qRT-PCR-Daten, dass die circRNAs mmu_circ_0001700 und mmu_circ_0001662 signifikant hochreguliert waren, während die circRNAs mmu_circ_0001859, mmu_circ_0000626 und mmu_circ_0000460 in der WD-Gruppe signifikant herunterreguliert waren. Diese Ergebnisse stimmten mit RNA-seq überein, was darauf hindeutet, dass RNA-seq-Daten verfügbar sind.

qRT-PCR-Validierung der DE-circRNA-Kandidaten.

Wir haben ein PPI-Netzwerk basierend auf der in Abb. 5a gezeigten Interaktion von DE-mRNAs mit Proteinen aufgebaut. Detaillierte Informationen zu Wechselwirkungen sind in der Ergänzungstabelle S4 aufgeführt. Wir haben die zehn wichtigsten Schlüsselgene mit den höchsten Gradwerten zusammengefasst: Srsf1, Smarca2, Ppp1cc, Tia1, Ngf, Shank3, Ptk2b, Tcf3, Scn1a und Ikzf.

Visualisierungen des PPI-Netzwerks und funktionale Anreicherungsanalyse von DEGs. (a) Das PPI-Netzwerk wurde mit Cytoscape (v3.9.1) identifiziert. Je höher der Gradwert, desto dunkler ist die Farbe. (b) GO-Anreicherungsanalysen von DEGs wurden mit den OECloud-Tools (https://cloud.oebiotech.cn) durchgeführt. (c) KEGG-Anreicherungsanalysen von DEGs wurden mit den OECloud-Tools durchgeführt. (d) Reaktomanreicherungsanalysen von DEGs wurden mit den OECloud-Tools durchgeführt.

GO-Analysen, angereichert mit biologischen Prozessen, einschließlich der Organisation des Mikrotubuli-Zytoskeletts (GO: 0000226), der Hämopoese (GO: 0030097) und der Entwicklung von Neuronenprojektionen (GO: 0031175), der zellulären Komponente einschließlich Zytoskelett (GO: 0,005,856) und Zytoplasma (GO: 0005737). und Synapse (GO: 0045202), molekulare Funktion einschließlich Aktivatoraktivität des Transmembranrezeptorproteins Tyrosinkinase (GO: 0030297), Proteinbindung (GO: 0005515) und Haptoglobinbindung (GO: 0031720) (Abb. 5b). KEGG-Signalwege angereichert mit mRNA-Überwachungsweg (mmu03015), Kalzium-Signalweg (mmu04020), afrikanischer Trypanosomiasis (mmu05143) und dopaminerger Synapse (mmu04728) et al. (Abb. 5c). Die Anreicherung des Reaktoms wurde in Abb. 5d gezeigt, z. B. wenn p75NTR Signalkomplexe rekrutiert (R-MMU-209543), NF-kB aktiviert wird und Überleben signalisiert (R-MMU-209560) und NRIF den Zelltod aus dem Zellkern signalisiert (R-MMU-209543). MMU-205043). Alle Anreicherungsergebnisse wurden in der Ergänzungstabelle S5 angezeigt.

Zwei KEGGs im Zusammenhang mit der Hippocampus-Neurophysiologie und -Pathologie, wobei DEGs angegeben sind, sind in Abb. 6 dargestellt, darunter das Langzeitpotential (mmu04720) (Abb. 6a) und die glutamaterge Synapse (mmu04724) (Abb. 6b).

Zwei KEGGs im Zusammenhang mit der Neurophysiologie und Pathologie des Hippocampus und DEGs wurden in Zitaten aus der KEGG-Datenbank (www.kegg.jp/feedback/copyright.html) angegeben. (a) Langfristiges Potenzial (mmu04720); (b) Glutamaterge Synapse (mmu04724). Grün steht für die Herunterregulierung des Gens, während Rot für die Hochregulierung des Gens steht.

Kompetitive endogene RNA (ceRNA)-Regulationsnetzwerke spielen bei verschiedenen menschlichen Krankheiten eine entscheidende Rolle. Wir haben ein dreifaches regulatorisches Netzwerk aus circRNA-miRNA-mRNA und lncRNA-miRNA-mRNA basierend auf den oben genannten unterschiedlich exprimierten ncRNAs konstruiert. Die funktionellen Teile und potenziellen Mechanismen dieses Netzwerks wurden durch funktionelle Anreicherungsanalyse bewertet.

In dieser Studie haben wir 75 differenzielle circRNAs, 1216 miRNAs und 333 mRNAs im circRNA-bezogenen ceRNA-Regulationsnetzwerk erhalten, wie in Abb. 7a gezeigt. Fünf circRNAs, darunter circRNA.1742, circRNA.3006, circRNA.4795, circRNA.7584 und circRNA.9442, wurden als potenzielle zentrale circRNA angesehen, und 11 miRNAs, darunter mmu-miR-149-3p, mmu-miR-1946a, mmu- miR-1946b, mmu-miR-328-5p, mmu-miR-3470a, mmu-miR-3470b, mmu-miR-3473b, mmu-miR-3473d, mmu-miR-3547-5p, mmu-miR-6931- 5p und mmu-miR-7045-3p wurden als Schlüssel-miRNAs angesehen (Abb. 7b – d). Wir haben verwandte ceRNA-Genpaare abgeleitet, wie z. B. circRNA 7584/mmu-miR-1946a/Cacna1i, circRNA 7817/mmu-miR-6931-5p/Fosb usw. Spezifische Informationen zu circRNA-bezogenen ceRNA-Netzwerken wurden in der Ergänzungstabelle S6 bereitgestellt. Detaillierte Informationen zu 12 Algorithmen sind in der Ergänzungstabelle S7 aufgeführt.

Der Aufbau von circRNA-miRNA-mRNA-ceRNA-Netzwerken, dargestellt von Cytoscape (v3.9.1). (a) CircRNA-assoziierte ceRNA-Netzwerke. Rote Rautenknoten stellen deutlich unterschiedliche circRNAs dar, blaue Rechteckknoten stellen ihre vorhergesagten miRNAs dar und rosa Ellipsenknoten stellen die vorhergesagten mRNAs dar. (b) Die Top-10-Hub-Gene im ceRNA-Netzwerk wurden nach der Degree-Methode berechnet. (c) Die Top-10-Hub-Gene im ceRNA-Netzwerk wurden mit der EPC-Methode berechnet. (d) Die Top-10-Hub-Gene im ceRNA-Netzwerk wurden mit der MCC-Methode berechnet.

Ein lncRNA-assoziiertes ceRNA-Netzwerk mit 2337 lncRNAs, 113 miRNAs und 330 mRNAs sowie die Netzwerkkarte mit den 500 wichtigsten Genen sind in Abb. 8a dargestellt. Nach der Berechnung wurden ENSMUST00000145250, ENSMUST00000180800, NONMMUT015424.2 als zentrale lncRNA betrachtet, mmu-miR-1195, mmu-miR-1893, mmu-miR-1946a, mmu-miR-3470b, mmu-miR-3473d, mmu-miR -3620-3p, mmu-miR-3960, mmu-miR-5126, mmu-miR-6931-5p wurden als Hub-miRNA betrachtet (Abb. 8b – d). Wir haben mehrere ceRNA-Genpaare identifiziert, die möglicherweise eine entscheidende Rolle spielen, wie z. usw. Spezifische Informationen zu lncRNA-bezogenen ceRNA-Netzwerken wurden in der Ergänzungstabelle S8 bereitgestellt, und detaillierte Informationen zu 12 Algorithmen wurden in der Ergänzungstabelle S9 aufgeführt.

Der Aufbau von lncRNA-miRNA-mRNA-ceRNA-Netzwerken, dargestellt von Cytoscape (v3.9.1). (a) LncRNA-assoziierte ceRNA-Netzwerke. Lila Dreiecksknoten stellen deutlich unterschiedliche lncRNAs dar, orangefarbene runde Rechteckknoten stellen ihre vorhergesagten miRNAs dar und dunkelgraue Sechseckknoten stellen die vorhergesagten mRNAs dar. (b) Die Top-10-Hub-Gene im ceRNA-Netzwerk wurden mit der Clustering-Koeffizienten-Methode berechnet. (c) Die Top-10-Hub-Gene im ceRNA-Netzwerk wurden mit der EPC-Methode berechnet. (d) Die Top-10-Hub-Gene im ceRNA-Netzwerk wurden mit der Stress-Methode berechnet.

Wir führten eine GO/KEGG-Anreicherungsanalyse durch, indem wir getrennt auf mRNAs in zwei ceRNA-Netzwerken abzielten. Das funktionelle Anreicherungsnetzwerk von circRNA-assoziierten ceRNA-Targeting-mRNAs ist in Abb. 9a dargestellt. Die GO- und KEGG-Ergebnisse der herunterregulierten mRNA-Funktionsanreicherung sind in Abb. 9b, c dargestellt. GO-Analysen (Abb. 9b), angereichert mit Zellverbindung (GO: 0030054), Zellprojektion (GO: 0042995), Synapse (GO: 0045202), Zytoplasmavesikel (GO: 0031410) und KEGG-Analysen (Abb. 9c), angereichert mit Amphetaminabhängigkeit (mmu05031), adrenerge Signalübertragung in Kardiomyozyten (mmu04261), Tight Junction (mmu04530) usw. Die GO- und KEGG-Ergebnisse der hochregulierten mRNA-Funktionsanreicherung wurden in Abb. 9d, e dargestellt. GO-Analysen (Abb. 9d) angereichert mit Zytoplasma (GO: 0005737), Proteinbindung (GO: 0005515), Kern (GO: 0005634), Metallionenbindung (GO: 0046872) und KEGG-Analysen (Abb. 9e) angereichert mit Ras-Signalweg (mmu04014), PI3K-Akt-Signalweg (mmu04151), Salmonelleninfektion (mmu05132) usw. Die Anreicherungsergebnisse wurden in der Ergänzungstabelle S10 angezeigt.

Anreicherungsnetzwerkanalyse von mRNAs, die auf circRNAs abzielen, die mit OECloud-Tools analysiert wurden (https://cloud.oebiotech.com). (a) Das funktionelle Anreicherungsnetzwerk von circRNA-assoziierten ceRNA-Targeting-mRNAs. (b, c) Die Anzahl der Gene im GO/KEGG-Term herunterregulierter mRNAs, die auf circRNAs abzielen. (d, e) Die Anzahl der Gene im GO/KEGG-Term hochregulierter mRNAs, die auf circRNAs im Hippocampus von tx-J-Mäusen abzielen.

Das funktionelle Anreicherungsnetzwerk von lncRNA-assoziierten ceRNA-Targeting-mRNAs ist in Abb. 10a dargestellt. GO/KEGG-Ergebnisse der herunterregulierten mRNA-Funktionsanreicherung sind in Abb. 10b, c dargestellt. GO-Analysen (Abb. 10b) angereichert mit Oxidoreduktaseaktivität (GO: 0016491), Calciumionenbindung (GO: 0005509), Mikrotubuli-basierter Bewegung (GO: 0007018), Mikrotubuli (GO: 0005874), apikaler Plasmamembran (GO: 0016324). ) und KEGG-Analysen (Abb. 10c), angereichert mit Pathways of Neurodegeneration-Multiple Diseases (mmu05022), Huntington-Krankheit (mmu05016), Neuroactive Ligand-Receptor Interaction (mmu05014) usw. Die GO- und KEGG-Ergebnisse der hochregulierten mRNA-Funktionalität Die Anreicherung wurde in Abb. 10d, e, demonstriert. GO-Analysen (Abb. 10d), angereichert mit der Regulierung der Zytokinproduktion (GO: 0001817), des xenobiotischen Stoffwechselprozesses (GO: 0006805), des Ubiquitin-Ligase-Komplexes (GO: 0000151) und KEGG-Analysen (Abb. 10e), angereichert mit Ubiquitin-vermittelter Proteolyse (mmu04120), Pathways of Neurodegeneration-Multiple Diseases (mmu05022) usw. Alle Anreicherungsergebnisse wurden in der Ergänzungstabelle S11 angezeigt.

Anreicherungsnetzwerkanalyse von mRNAs, die auf lncRNAs abzielen, die mit OECloud-Tools analysiert wurden (https://cloud.oebiotech.com). (a) Das funktionelle Anreicherungsnetzwerk von lncRNA-assoziierten ceRNA-Targeting-mRNAs. (b, c) Die Anzahl der Gene im GO/KEGG-Term herunterregulierter mRNAs, die auf lncRNAs abzielen. (d, e) Die Anzahl der Gene im GO/KEGG-Term hochregulierter mRNAs, die auf lncRNAs im Hippocampus von tx-J-Mäusen abzielen.

Basierend auf dem Pearson-Korrelationskoeffizienten |r|> 0,7 und dem P <0,05 erhielten wir 2051 coexprimierte circRNA-mRNA-Genpaare, darunter 92 circRNAs und 397 mRNAs, wie in Abb. 11a gezeigt. Zu den fünf circRNAs mit der höchsten Korrelation gehören „circRNA.1641“, „circRNA.2061“, „circRNA.4258“, „circRNA.4898“, „circRNA.7366“ und „circRNA.7621“. Die algorithmenbasierten Teilnetze sind in Abb. 11b–d dargestellt. Die Informationen zu den circRNA-mRNA-Paaren wurden in der Ergänzungstabelle S12 angezeigt und detaillierte Informationen zu 12 Algorithmen wurden in der Ergänzungstabelle S13 aufgeführt.

Visualisierungen des circRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerks und der Subnetzwerke, angezeigt von Cytoscape (v3.9.1). (a) CircRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerk. Rote Rautenknoten stellen circRNAS dar. Rosafarbene Eclipse-Knoten repräsentieren mRNAs. (b) Die Top-10-Hub-Gene im circRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerk wurden mit der MCC-Methode berechnet. (c) Die Top-10-Hub-Gene im circRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerk wurden mit der Radiality-Methode berechnet. (d) Die Top-10-Hub-Gene im circRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerk wurden mit der Stress-Methode berechnet.

Wir haben ein lncRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerk mit demselben Schwellenwert mit 2627 lncRNAs und 361 mRNAs in Abb. 12a aufgebaut. Wir haben acht lncRNAs als entscheidende lncRNAs identifiziert, darunter „MSTRG.18029.6“, „MSTRG.24543.1“, „NONMMUT014183.2“, „NONMMUT059281.2“, „NONMMUT072370.2“, „NONMMUT072383.2“, „NONMMUT147148.1“. , „NONMMUT148168.1“. Die auf den drei Algorithmen basierenden Teilnetze sind in Abb. 12b–d dargestellt. Die Informationen zum lncRNA-mRNA-Genpaar sind in der Ergänzungstabelle S14 aufgeführt, und detaillierte Informationen zu 12 Algorithmen sind in der Ergänzungstabelle S15 aufgeführt.

Visualisierungen des lncRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerks und der Subnetzwerke, angezeigt von Cytoscape (v3.9.1). (a) LncRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerk. Lila Dreiecksknoten stellen lncRNA dar. Dunkelgraue Sechseckknoten stellen mRNAs dar. (b) Die Closeness-Methode berechnet die Expressionskarten der Top-10-Hub-Gene im lncRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerk. (c) Die EPC-Methode berechnet die Expressionskarten der zehn wichtigsten zentralen Gene im lncRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerk. (d) Die Stress-Methode berechnet die Expressionskarten der Top-10-Hub-Gene im circRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerk.

Die aktuelle Arbeit ist die erste Transkriptomanalyse von circRNAs, lncRNAs und mRNAs im Hippocampus des tx-J-Mausmodells von WD. In diesen Modellen werden unterschiedlich exprimierte circRNAs, lncRNAs und mRNAs mit den Mechanismen in Verbindung gebracht, durch die kognitive Beeinträchtigungen bei WD auftreten. Wir konzentrierten uns auf die beteiligten Komponenten nicht-kodierender RNAs im ceRNA-Netzwerk und ihre Auswirkungen auf zelluläre Funktionen. Wir analysieren die charakteristische Beteiligung nichtkodierender RNAs in ceRNA-Netzwerken, die kognitive Beeinträchtigungen bei WD regulieren, was zur Erforschung von Biomarkern für die Diagnose oder Prognose kognitiver Beeinträchtigungen bei WD auf molekularer Ebene beiträgt.

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass Veränderungen der RNA-Transkription und des Stoffwechsels für die Entwicklung komplexer Symptome und Krankheiten von entscheidender Bedeutung sind. Nichtkodierende RNAs stellen den Großteil des Transkriptoms des Organismus dar, das im Zentralnervensystem reichlich vorhanden ist und intensiv an der Transkriptionsregulation von RNAs beteiligt ist, wodurch sie mit den Mechanismen vieler neurologischer Symptome und Krankheiten in Verbindung gebracht werden17. Mehrere Studien haben gezeigt, dass kodierende und nicht-kodierende RNAs die Transkription durch die Bindung von miRNAs regulieren und somit die nachgeschaltete Zielgenexpression beeinflussen, was als kompetitiver endogener RNA-Mechanismus bekannt ist18. Dieses Muster der Genregulation kann verwendet werden, um die Komplexität einer Art oder ihres Phänotyps zu erklären19.

Studien haben gezeigt, dass bis zu 60 % der WD-Patienten bei der Vorstellung neurologische oder psychiatrische Symptome aufweisen20, einschließlich motorischer, kognitiver und Verhaltensdefizite, und dass eine anhaltende oder fortschreitende kognitive Dysfunktion vorliegt, selbst bei Patienten, die mit „Kupferentgiftung“ behandelt werden, und bei Patienten mit … oder ohne Kupferansammlung im Gehirn21. Wie bereits erwähnt, sind tx-J-Mäuse derzeit ein ideales Modell für die Untersuchung der Transkriptomsequenzierung von WD und verwandten Phänotypen. In dieser Studie haben wir das Vorliegen einer kognitiven Beeinträchtigung bei tx-J-Mäusen durch einen Wasserlabyrinthtest bestätigt, einschließlich verminderter räumlicher Lern- und Gedächtnisfähigkeiten. In Bezug auf die morphologische Untersuchung der Hippocampusstrukturen zeigten tx-J-Modellmäuse eine Zerstörung neuronaler Zellen in der Region des Gyrus dentatus des Hippocampus. Sie verringerten die Anzahl neuer neuronaler Zellen deutlich. Dies weist darauf hin, dass bei tx-J-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen eine erkennbare kognitive Beeinträchtigung vorliegt. Einerseits kann dieser Nachweis einer kognitiven Beeinträchtigung die Wissenschaftlichkeit von Tiermodellen verbessern und die Zuverlässigkeit der Sequenzierungsergebnisse stärken.

In dieser Studie führten wir die differenzielle Expressionsanalyse von mRNA\circRNA\lncRNA durch, konstruierten ein PPI-Expressionsnetzwerk sowie das ncRNA-bezogene ceRNA-Netzwerk und das ncRNA/mRNA-Koexpressionsnetzwerk im Hippocampusgewebe von WD-Modell-tx-J-Mäusen für das erste Mal. Wir haben 361 Grad untersucht. Viele dieser signifikant unterschiedlich exprimierten Zielgene stehen in engem Zusammenhang mit der Pathologie kognitiver Beeinträchtigungen. Wir fanden heraus, dass einige mRNAs, auf die miRNA in ncRNA-assoziierten ceRNA-Regulationsnetzwerken abzielt, auch unterschiedlich exprimierte mRNAs waren, wie Fosb, Shank3 und Cacna1i usw.

Fosb ist ein aktivitätsabhängiger Transkriptionsfaktor, der sich aufgrund seiner langen Halbwertszeit bei chronischer Zellaktivität ansammelt und zurückgehalten wird22. Fosb spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Gedächtnisses im Hippocampus. Studien haben bestätigt, dass die Fosb-Familie viele suchtbezogene Ziele entscheidender Zielgene durch Histonmodifikationen reguliert23. Es wurde auch gezeigt, dass eine Überexpression von Fosb im Hippocampus das Lernen und das Gedächtnis beeinträchtigen kann24. Eine Studie, die die Fosb-Regulation der Genexpression in AD-Modellmäusen mit kognitiver Dysfunktion untersucht, legt nahe, dass Fosb die Expression von c-Fos, einem frühen Gen, das für Plastizität und Kognition entscheidend ist, unterdrücken kann, indem es an Promotoren bindet und die Histon-Deacetylierung auslöst, und dass die langen Halb- Das Leben von Fosb macht es zu einer möglichen Ursache für das Fortbestehen kognitiver Defizite25. Als erregendes postsynaptisches Gerüstprotein wirkt SHANK3 auf verschiedene postsynaptische Dichteproteine, um postsynaptische Neurotransmitterrezeptoren und Signalmoleküle zu regulieren26. Eine Studie, die auf der Vorhersage von Einzelgenvariantenwerten bei Autismus-Spektrum-Störungen (ASD) basiert, zeigte, dass SHANK3-mRNA-Werte die synaptische Übertragung im Hippocampus von Mäusen beeinflussen, was möglicherweise zu einer langfristigen Depression und einer langfristigen Beeinträchtigung von Lernen und Gedächtnis führt27. Es wurde festgestellt, dass das spannungsgesteuerte Calciumkanal-Gen (Cav) CACNA1I (Cav3.3) als Risikofaktor für Schizophrenie gilt und dass Varianten dieses Gens zu einer Störung der neuronalen Erregbarkeit und Gehirnnetzwerkaktivität führen und Prozesse wie die Freisetzung von Sendern beeinflussen , Empfindung, Gedächtnis und Schlaf28.

Nichtkodierende RNA ist eine Klasse von RNA-Molekülen, die keine Proteine ​​kodieren und etwa 98–99 % der gesamten RNA im Säugetiergenom ausmachen29. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass nicht-kodierende RNAs eine wichtige regulatorische Rolle spielen, indem sie aktiv mit anderen Molekülen interagieren. Beispielsweise interagiert eine nichtkodierende RNA mit einem oder mehreren Zielmolekülen, um Zellen oder Wege zu regulieren und so normale physiologische oder pathologische Prozesse zu beeinflussen, einschließlich der Regulierung neurologischer Erkrankungen30. CircRNAs sind eine Klasse kovalent geschlossener, einzelsträngiger zyklischer Moleküle ohne 5'-Kappen und 3'-polyadenylierte Schwänze31, die stabil, reichlich vorhanden und konserviert sind32 und ein einzigartiges Potenzial für die medizinische Forschung haben. In dieser Studie haben wir das circRNAs-Profil im Hippocampus-Gewebe mit WD identifiziert und 99 signifikante DECs herausgesucht. Insbesondere standen mmu_circ_0001859 und mmu_circ_0000242 in engem Zusammenhang mit der Axon-Führung, dem Wnt-Signalweg, dem Calcium-Signalweg, dem MAPK-Signalweg, der fokalen Adhäsion, dem Neurotrophin-Signalweg, dem TGF-beta-Signalweg, dem Zellzyklus, dem ErbB-Signalweg, dem Notch-Signalweg und p53 Signalweg, Fc-Gamma-R-vermittelte Phagozytose usw.

Studien haben die biologischen Funktionen von circRNAs bestätigt, wie z. B. die Beteiligung an der Transkriptionsregulation im Zellkern, die Funktion als endogene Adsorber von miRNAs, Template für die Protein- oder Peptidtranslation und Regulatoren der Genexpression33. CircRNA kommt im Gehirn von Säugetieren außergewöhnlich häufig vor, wird während der neuronalen Differenzierung insgesamt hochreguliert, ist stark an Neurosynapsen angereichert und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung neuropsychiatrischer Störungen34. Eine auf tiefer RNA-Sequenzanalyse basierende Studie klärte systematisch den kranialen circRNA-assoziierten ceRNA-Mechanismus in einer AD-Modellmaus (APP/PS1-Mäuse) auf und stellte fest, dass das circRNA-assoziierte ceRNA-Netzwerk in dieser Modellmaus hauptsächlich an der dendritischen Entwicklung und dem Gedächtnis beteiligt ist ( Sorbs2) und die neurologische Entwicklung von Mäusen (ALS2), die neue Ideen für die klinische Diagnose und Behandlung von AD35 liefern. Die erste Untersuchung von hippocampalen circRNA-Expressionsprofilen bei älteren Mäusen mit POCD legt nahe, dass das ceRNA-Netzwerk mmu_circRNA_22058 und circRNA_44122\Egfr oder das ceRNA-Netzwerk circRNA_22673\Prkacb eine bedeutende Rolle im Verlauf der POCD-Erkrankung spielen könnte36. In dieser Studie identifizierten wir 99 signifikant unterschiedlich exprimierte circRNAs im Hippocampusgewebe von WD-Modell-tx-J-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. Wir haben ein ceRNA-Netzwerk basierend auf unterschiedlich exprimierten circRNAs aufgebaut und eine funktionelle Anreicherungsanalyse durchgeführt. Wir führten GO- und KEGG-Analysen sowohl an hoch- als auch an herunterregulierten Genen von circRNA-assoziierten ceRNA-Netzwerken durch und identifizierten eine Reihe angereicherter Begriffe, die mit neurologischen Erkrankungen und kognitiven Prozessen verbunden sind. In unseren Ergebnissen wurde GO hochregulierter Gene im Zytoplasma (GO: 0005737), in der Proteinbindung (GO: 0005515), im Zellkern (GO: 0005634) und in der Metallionenbindung (GO: 0046872) angereichert. Im Gegensatz dazu war KEGG im Ras-Signalweg (mmu04014), im PI3K-Akt-Signalweg (mmu04151), im Calcium-Signalweg (mmu04020) usw. angereichert. GO herunterregulierter Gene waren im Zellübergang angereichert (GO: 0030054). Zellprojektion (GO: 0042995), Synapse (GO: 0045202) und zytoplasmatische Vesikel (GO: 0031410) und KEGG wurde mit Amphetaminsucht (mmu05031), adrenergen Signalen in Kardiomyozyten (mmu04261), Tight Junction (mmu04530) und zirkadian angereichert Mitnahme (mmu04713). Wir haben mehrere ceRNA-Netzwerke identifiziert, die zum Fortschreiten der kognitiven Beeinträchtigung bei WD beitragen können. Beispielsweise können im ceRNA-Netzwerk mit mmu-miR-6931-5p als Kern und Fosb als Zielgen die vorgelagerten 44 circRNAs mmu-miR-6931-5p als Schwamm binden, um die Expression von Fosb-Zielgenen zu regulieren.

Im Gegensatz zu circRNAs sind LncRNAs länger als 200 Nukleotide und haben 5'-Endkappen und multimere Schwänze am 3'-Ende, sodass sie durch die Oligonukleotid-basierte RNA-Sequenzierung leicht erkannt werden37. Die Expression von lncRNAs im Gehirn ist gewebespezifisch38 und Studien haben das Vorhandensein regionaler und zellspezifischer Expressionsmuster von lncRNAs in kognitiv relevanten Gedächtnisregionen des Gehirns wie dem Hippocampus, dem präfrontalen Kortex und der Amygdala39 bestätigt, wie z. B. lncRNA Gm9968. das im Hippocampusgewebe der Maus deutlich angereichert ist, spielt eine wichtige Rolle bei Krankheiten wie Alzheimer und Epilepsie. Viele lncRNAs mit kognitiver Relevanz in vivo oder in vitro-Modellen wurden nachgewiesen. Beispielsweise kann LncRNA Rian die LIMK1-Expression reduzieren, indem es miR143-3p negativ reguliert. Somit kann die Modulation der LncRNA-Rian/miR143-3p/LIMK1-Achse die kognitive Dysfunktion nach einer Sevofluran-Anästhesie verbessern40. Eine Studie über den Mechanismus der Wirkung von LncRNA MEG3 auf die kognitive Funktion bei AD-Modellratten zeigte, dass eine Hochregulierung von LncRNA MEG3 neuronale Schäden hemmte, die Aβ-positive Expression reduzierte und die Entzündungsindizes bei AD-Ratten verbesserte, was auch zu einer Verbesserung der kognitiven Funktion führte41. In Mausmodellen mit vaskulärer kognitiver Beeinträchtigung kann LncRNA TUG1 BDNF-Proteine ​​binden und mit ihnen interagieren, und seine Überexpression kann bei Mäusen nach VCI42 zu kognitiven Dysfunktionen führen. Wir identifizierten 2627 DELs im Hippocampusgewebe von WD-Modell-tx-J-Mäusen und führten eine funktionelle Anreicherungsanalyse in den konstruierten lncRNA-assoziierten ceRNAs durch. Darunter wurden die hochregulierten Zielgene GO bei der Regulierung der Zytokinproduktion (GO: 0001817), des xenobiotischen Stoffwechselprozesses (GO: 0006805), des Ubiquitin-Ligase-Komplexes (GO: 0000151), des späten Endosoms (GO: 0005770) und des Ubiquitin-Gens angereichert. konjugierende Enzymaktivität (GO: 0061631), Transkriptions-Corepressor-Aktivität (GO: 0003714), KEGG-Anreicherung in der Ubiquitin-vermittelten Proteolyse (mmu04120), Wege der Neurodegeneration – multiple Krankheiten (mmu05022). Herunterregulierte Expression von Zielgenen GO ist angereichert mit Oxidoreduktase-Aktivität (GO: 0016491), Calciumionenbindung (GO: 0005509), Mikrotubuli-basierter Bewegung (GO: 0007018), Mikrotubuli (GO: 0005874) und apikaler Plasmamembran (GO). : 0016324), Cilium (GO: 0005929). Die KEGG-Analyse ist bereichert um Pathways of Neurodegeneration – Multiple Diseases (mmu05022), Huntington-Krankheit (mmu05016), Amyotrophe Lateralsklerose (mmu05014) und Neuroactive Ligand-Receptor Interaction (mmu04080). Beispielsweise kann im ceRNA-Netzwerk, das auf SHANK3 abzielt, die obere lncRNA NONMMUT015424.2 (lncRNA D130020L05Rik) mmu-miR-5126 als Schwamm verwenden, um die Transkriptionsexpression von SHANK3 durch Bindung daran zu regulieren. Unser vorhergesagtes ncRNA-ceRNA-Netzwerkmodell könnte zur Entwicklung einer kognitiven Beeinträchtigung bei WD beitragen, und die Funktion dieser Netzwerke erfordert eine weitere experimentelle Validierung.

Die in diesem Artikel vorgestellte Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens kann die geringe Stichprobengröße die Generalisierbarkeit der Ergebnisse einschränken. Darüber hinaus sind Ergebnisse aus Tiermodellen möglicherweise nicht vollständig repräsentativ für das Transkriptionsprofil aller Phänotypen der Wilson-Krankheit (WD), einschließlich weiblicher Mäuse und menschlicher Patienten. Zweitens war die Beurteilung des räumlichen Lernens und Gedächtnisses bei Mäusen möglicherweise nicht umfassend genug. Darüber hinaus untersuchte diese Studie ausschließlich das Transkriptionsprofil des Hippocampus im WD-Tiermodell und andere Kupferablagerungsgewebe wurden nicht untersucht, was bedeutet, dass es nicht möglich war, die Genexpression in verschiedenen Geweben zu untersuchen. Darüber hinaus mangelt es den Ergebnissen der Studie an experimenteller Validierung, einschließlich Genen mit signifikanten Expressionsunterschieden und prädiktiven Netzwerkmodellen, was robuste Experimente erfordert, um Beweise für die Ergebnisse zu liefern. Obwohl unsere Studie auf der Grundlage der Transkriptomik Licht auf die Mechanismen der kognitiven Beeinträchtigung bei WD wirft, erkennen wir an, dass der Expressionsregulationsmechanismus von Transkriptionsmolekülen komplex ist und weiterer Forschung bedarf, beispielsweise zur Regulierung epigenetischer Modifikationen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Untersuchung der pathologischen phänotypischen Mechanismen von Krankheiten ein anspruchsvolles und zeitaufwändiges Unterfangen ist. Allerdings hat die Weiterentwicklung der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie die Erforschung der molekularen Mechanismen, die Krankheiten zugrunde liegen, erheblich erleichtert. Unsere Untersuchung des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) und des nichtkodierenden RNA-konkurrierenden endogenen RNA-Netzwerks (ncRNA-ceRNA) im Hippocampusgewebe von tx-J-Mäusen, einem Modell der Wilson-Krankheit (WD), hat wichtige Implikationen für die Identifizierung potenzielle Biomarker und Zielwerte, die für die Diagnose, Behandlung und Entwicklung von Medikamenten gegen kognitive Beeinträchtigungen bei WD unerlässlich sind.

Für die Studie wurden zehn männliche tx-J-Mäuse (C3HeB/FeJ-Atp7b tx-J/J) mit einem Gewicht von 20 ± 2 g und zehn männliche Wildtyp-Mäuse (C3HeB/FeJ) im Alter von 8–10 Wochen verwendet, die vom Jackson Laboratory erworben wurden Beijing Vital River Laboratory Animal Technology, Ltd. Alle Mäuse wurden einzeln in Käfigen mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit (50–70 %), Raumtemperatur (18–22 °C) und getrennter Luftzufuhr gehalten, mit freiem Zugang zu Futter und Wasser darunter ein abwechselnder 12-Stunden-Hell-/Dunkel-Zyklus für acht Wochen. Bei dieser Studie gab es eine Überschneidung der Tieruntergruppen; Drei der vier tx-J-Mäuse wurden nach dem MWM-Test einer Hochdurchsatzsequenzierung unterzogen, vier der verbleibenden sieben Mäuse wurden einem histopathologischen Test des Hippocampus unterzogen und die restlichen drei wurden qRT-PCR-Experimenten unterzogen. Auch die Wildtyp-Mäuse wurden nach diesem Protokoll behandelt. Es wurde gezeigt, dass Östrogen die Neuroplastizität in mehreren Gehirnregionen beeinflusst, neuronale Synapsen und die Bildung des Hippocampus reguliert und vermittelt sowie Lernen und Gedächtnis beeinflusst43. Daher wurden männliche Mäuse als Versuchsobjekte ausgewählt, um diese Effekte zu minimieren.

Die in dieser Studie verwendeten Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften der ARRIVE2.0-Richtlinien44 durchgeführt. Die Ethikkommission für Versuchstiere der Anhui-Universität für Traditionelle Chinesische Medizin überprüfte und genehmigte das Tierverwendungsprotokoll (Genehmigungsnummer: AHUCM-mouse-2021125).

Das Morris-Wasserlabyrinth-Experiment wird routinemäßig zur Beurteilung des räumlichen Lernens und der Gedächtnisfähigkeiten von Nagetieren verwendet. Es bestand aus einem schwarzen kreisförmigen Becken (50 cm hoch und 90 cm im Durchmesser), das mit 45 cm hohem Wasser bei 21–23 °C gefüllt und mit Wasser vermischt wurde ein weißer, ungiftiger, geruchloser Farbstoff, in dem ein schwarzer runder Tisch 1 cm unter Wasser in der Mitte des vierten Quadranten befestigt wird. Für das Experiment wurden jeweils vier Mäuse aus den beiden Gruppen ausgewählt. Im Positionierungsnavigationsexperiment wurden die beiden Mäusegruppen in einem 45°-Winkel mit Blick auf die Beckenwand in einem der vier Ost-, West-, Süd- und Nordquadranten ins Wasser gesetzt und viermal täglich getestet. Wenn die Mäuse innerhalb der 60 s auf die versteckte Plattform kletterten und länger als 5 s auf der Plattform blieben, wurde davon ausgegangen, dass sie die Plattform gefunden hatten. Als Fluchtlatenz wurde die Zeit vom Wassereintritt bis zum Auffinden der Plattform aufgezeichnet. Wenn die Mäuse die Plattform nicht innerhalb der 60 Sekunden fanden, wurden sie zur Plattform geführt und blieben dort 10 Sekunden lang. Die Fluchtlatenz wurde mit 60 Sekunden aufgezeichnet. Vergleichen Sie die Fluchtlatenz des gegenüberliegenden Plattformquadranten, die durchschnittliche Fluchtlatenz von drei Quadranten mit Ausnahme des Plattformquadranten, die Schwimmdistanz des gegenüberliegenden Plattformquadranten und die Gesamtschwimmdistanz mit Ausnahme des Plattformquadranten am fünften Tag zwischen den beiden Gruppen .

Vier Mäuse aus jeder Gruppe wurden für die Hippocampus-Histopathologie ausgewählt. Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (2 ml/kg; Shanghai Chemical Reagent Company) nach 12-stündigem Fasten anästhesiert und ihnen wurde bilaterales Hippocampusgewebe entnommen, mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Ethanol und Xylol dehydriert, in klares Paraffin eingebettet, geschnitten, verzögert, mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, weiter dehydriert und versiegelt und unter einem Lichtmikroskop beobachtet.

Nachdem wir Hippocampus-Gewebe in den WD- und Kontrollgruppen auf Eisboxen isoliert hatten, führten wir eine Tiefensequenzierung von Ribosomen-RNA-Proben aus dem Hippocampus von drei Kontroll- und drei tx-J-Mäusen durch.

Die Gesamt-RNA peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC) wurde mit dem MiRNeasy Mini Kit (Qiagen, Deutschland) hergestellt. Anschließend wurden das RNA Clean XP Kit (Kat.-Nr. A63987, Beckman Coulter, USA) und das RNase-Free DNase Set (Kat.-Nr. 79254, Qiagen, Deutschland) zur Reinigung der Gesamt-RNA verwendet. Die gereinigte RNA wurde mit zwei Instrumenten zum Nachweis des RNA-Gehalts und der RNA-Qualität quantifiziert: NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, USA) und ein Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, USA). Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden die Bibliotheken mit dem truseq®-Ketten-Gesamt-RNA-Probenvorbereitungskit (Illumina, USA) vorbereitet. Zur Quantifizierung der Bibliothek wurde ein Qubit 2.0-Fluorometer verwendet. Darüber hinaus wurden diese Bibliotheken mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer verifiziert. Nach Bestätigung der Größe und molaren Konzentration des eingefügten Fragments wurden die Bibliotheken mit CBOT auf 10 μm verdünnt, um Cluster zu erzeugen, und auf Illumina HiSeq 2500 (Illumina, USA) sequenziert. Die Bibliothek wurde bei OG Biotech Inc. (Aoji Biotech, Shanghai, China) erstellt und sequenziert.

Mithilfe von FastQC (v. 0.11.3, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)45 wurden die RNA-Seq-Reads quantifiziert. Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) entfernt die Adaptersequenz von Illumina TruSeq, mm10-ribosomalen RNA-Reads und Reads mit geringer Qualität. Anschließend wurden mithilfe von Hisat2 (Version: 2.0.4) gekürzte Lesevorgänge dem von Ensembl heruntergeladenen Maus-Referenzgenom (mm10) zugeordnet. Die Anzahl jedes Gens in ausgerichteten Lesevorgängen wurde von StringTie (Version 1.3.0) erfasst. Mit Perl-Skript wurde eine Normalisierung der Genzahlen und Fragmente pro Kilobase Transkript pro Million zugeordneter Lesevorgänge (FPKM) durchgeführt.

Für circRNAs wurden alle gültigen Sequenzierungsdaten mit den folgenden Schritten verarbeitet: 1) Die Daten wurden mit der BWA-MEM-Software (Version: 2.0.4) an das Mausgenom (http://genome.ucsc.edu/)46 angepasst; 2) Die Reads, die zusammenhängend mit den Genomen ausgerichtet waren, wurden verworfen; 3) Die nicht kartierten Lesevorgänge wurden mithilfe von CIRI-Algorithmen explizit auf Back-Splice-Junction-Stellen analysiert, um die möglichen circRNAs47 zu identifizieren, und die Zählungen wurden durch SRPBM (Spliced ​​Reads Per Billion Mapping) normalisiert. Gene, die einzelne circRNAs erzeugen, wurden identifiziert, indem die Genompositionen von circRNAs mit denen abgeglichen wurden, die von TopHat/Cufflinks mithilfe von BED-Tools erkannt wurden48. Die Konservierung von circRNA zwischen Menschen und Mäusen wurde mit dem UCSC Liftover-Tool analysiert. Es wurde verwendet, um die 3´- und 5´-Flankenkoordinaten jeder fehlregulierten circRNAs auf die Koordinaten des menschlichen Genoms abzubilden. Das Kriterium für die Homologie war der Nachweis der Spleißstellen innerhalb eines Abstands von ± 2 Nukleotiden um die mutmaßlichen menschlichen Stellen49.

Zur Identifizierung von lncRNAs wurden einspurige gepaarte Lesevorgänge mit einer Länge von 2 × 150 bp (PE150) mithilfe der Transkriptassemblierungssoftware StringTie zusammengestellt, um bekannte mRNAs und Transkripte mit einer Länge von < 200 bp zu entfernen. Die Vorhersagesoftware: Coding Potential Calculator (https://github.com/biocoder/cpc) und Coding Non-Coding Index (https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI#install-CNCI) für die lncRNA-Vorhersage der verbleibenden Transkripte wurden dann aus dem lncRNA-Datensatz gefiltert. Die Expressionsniveaus von lncRNAs wurden durch Fragmente pro Kilobase des Exon-Modells pro Million kartierter Lesevorgänge (FPKM) gemessen, und die Expressionshäufigkeit bekannter Gene in verschiedenen Proben wurde aus FPKM-Werten berechnet.

Die EdgeR-Methode wurde verwendet, um die unterschiedlich exprimierten Gene zu bestimmen, P <0,05 und |log2FC|> 1,5. Das Venn-Diagramm wird auf Jvenn aufgetragen (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)50. Die Vulkankarte wurde mit den OECloud-Tools unter https://cloud.oebiotech.com erstellt. Die Heatmap wurde mit Heatmapper (http://www.heatmapper.ca/)51 erstellt.

Echtzeit-qRT-PCR wurde im folgenden Reaktionssystem durchgeführt: 3,6 μl RNase-freies H2O, 0,2 μl Vorwärtsprimer (5 μM), 0,2 μl Rückwärtsprimer (5 μM), 1 μl cDNA-Matrize und 5 μl SYBR-Grün-Supermix (Abclonal, Wuhan, China) bei 95 °C für 30 Sekunden, gefolgt von einer 15-sekündigen Reaktion, und dann bei –60 °C für 15 s und 70 °C für 15 s, wobei 40-malige Zyklen durchgeführt wurden. Primer wurden von OG Biotech Inc (Aoji Biotech, Shanghai, China) entworfen und synthetisiert. Die relativen Expressionsniveaus der circRNAs wurden als 2−∆∆CT dargestellt.

Die STRING-Datenbank (https://cn.string-db.org/) ist eine integrierte Datenbank, die Informationen zu Protein-Protein-Wechselwirkungen liefert, nicht nur experimentelle Wechselwirkungen, sondern auch vorhergesagte Wechselwirkungen, die zur Vorhersage der DE-Wechselwirkungen verwendet wurden mRNAs mit Proteinen. Cytoscape (v3.9.1) wird zum Aufbau des PPI-Netzwerks verwendet. Mithilfe des MCAO-Plugins mit den Standardsätzen wurden die Module des PPI-Netzwerks mit Cytoscape identifiziert. Die Analyse der Anreicherung des GO- und KEGG-Signalwegs wurde mit den OECloud-Tools (https://cloud.oebiotech.cn) durchgeführt. Visualisieren Sie DEGs und verwandte Pfade über die Pathview-Website (https://pathview.uncc.edu/).

Alle Sequenzen von aus Mäusen stammenden miRNAs wurden aus der miRBase-Version 2152 erhalten. Die maßgeschneiderte Software von OG-Biotech, die auf der miRanda-Software und RNAhybrid basiert, wurde übernommen, um miRNA-Ziele vorherzusagen, die mit den DECs und DELs interagieren können.

Die Anzahl der vorhergesagten bindenden miRNAs wurde für alle circRNAs gezählt. Das mRNA-Ziel für die vorhergesagte Bindung von miRNAs wurde aus den Datenbanken miRdana53, targetScan54 und mirTarbase55 gesammelt. Der Venny wurde eingesetzt, um ein stark unterstütztes mRNA-Ziel zu erhalten, das von mindestens zwei Datenbanken vorhergesagt wurde. DECs und mRNAs, die dieselbe miRNA-Bindungsstelle teilen, stellten circRNA-miRNA-mRNA-Wechselwirkungen dar.

Für die cis-aktive Rolle von lncRNAs, die auf benachbarte Zielgene wirken, wurden kodierende Gene 10 kb/100 kb stromaufwärts und stromabwärts von lncRNA gesucht und ihre Funktionen analysiert. Für die transaktive Rolle von lncRNA, die anhand des Expressionsniveaus identifiziert wurde, wurde die ausgedrückte Korrelation zwischen lncRNAs und kodierenden Genen mit der R-Funktion „cor. test“ berechnet. Das ceRNA-Netzwerk wurde von der Cytoscape-Software visuell dargestellt.

Die Hub-Gene werden mithilfe der entsprechenden Algorithmen im Cytohubba-Plugin56 berechnet und angezeigt. Zu diesen 12 Algorithmen gehören Degree, Edge Percolated Component (EPC), Maximum Neighborhood Component (MNC), Density of Maximum Neighborhood Component (DMNC), Maximum Clique Centrality (MCC) und sechs Zentralitäten (Bottleneck, EcCentricity, Closeness, Radiality, Betweenness, und Stress) basierend auf kürzesten Wegen und dem Clustering-Koeffizienten. Alle Algorithmen und resultierenden Netzwerkdiagramme sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. S1 und S2.

Für die GO-Analyse wurden die Analysen des biologischen Prozesses (BP), der Zellkomponenten (CC) und der molekularen Funktion (MF) durchgeführt. Um die Funktion der DE circ-/lnc-/mRNAs besser zu verstehen, wurden die angereicherten Pfade von Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) mit OECloud-Tools analysiert (https://cloud.oebiotech.com). um die Funktion und den Nutzen des Transkriptoms von tx-J-Mäusen auf hoher Ebene aufzudecken, z. B. in Zellen, Organismen und Ökosystemen. Signifikante Anreicherungsterme für GO und Pfade wurden entsprechend dem Schwellenwert von P <0,05 ausgewählt.

Basierend auf den Matrixdaten von DELs/DECs/DEGs wurden die Pearson-Korrelationskoeffizienten zwischen DEL/mRNAs und DEC/mRNAs berechnet und der Schwellenwert |r|> 0,7 und P < 0,05 festgelegt, um ein Aufwärts-/Abwärtsdiagramm zu erhalten -regulierte Koexpressionsliste zwischen DEL/mRNAs und DEC/mRNAs. Die Visualisierung des Koexpressionsnetzwerks wurde mithilfe der 12 Algorithmen im Cytohubba-Plugin berechnet und angezeigt. Alle Algorithmen und resultierenden Netzwerkdiagramme sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. S3 und S4.

Statistische Analysen wurden mit Graphpad Prism 8 (Chicago, USA) durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Der Student-T-Test wurde mit den verbleibenden Daten durchgeführt und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die in diesem Artikel berichteten Rohsequenzdaten wurden im Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) im National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of, hinterlegt Naturwissenschaften57,58. Die Sequenzen im folgenden Format: https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/browse/CRA010567 und der Arbeitslink zum Bioprojekt als https://ngdc.cncb.ac.cn/bioproject/browse/PRJCA012480.

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Wir danken Herrn Qiang Fan (Aoji Bio-tech Co., Ltd., Shanghai, China) für seine Hilfe bei der Datenanalyse.

Enzephalopathie-Zentrum, das erste angegliederte Krankenhaus der Anhui-Universität für Chinesische Medizin, Nr. 117 Meishan Road, Bezirk Shushan, Hefei, 230031, Volksrepublik China

Daojun Xie, Juan Zhang, Bo Yang, Lei Zhou und Xiaofeng Huang

College of Integrated Chinese and Western Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, No. 1 Qianjiang Road, Xinzhan District, Hefei, 230012, Volksrepublik China

Dan Wang & Biao Cai

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DJX, JZ, BC, BY, LZ, XFH und DW hatten die Idee; DW und XFH durchsuchten die Literatur; DW führte Tierversuche und Materialien durch; DW erstellte das Manuskript mit Hilfe von DJX, JZ, BCDW zeichnete die Abbildung und korrigierte die Referenzen mit Hilfe von BY, LZ, XFH. Alle Autoren lasen und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Daojun Xie.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, D., Xie, D., Zhang, J. et al. Umfassende Analyse der kodierenden und nichtkodierenden RNA-Transkriptom-Expressionsprofile von Hippocampus-Gewebe im tx-J-Tiermodell der Wilson-Krankheit. Sci Rep 13, 9252 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36503-8

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Eingegangen: 29. September 2022

Angenommen: 05. Juni 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36503-8

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